试 剂 配 置

秋水仙碱（秋水仙素Colchicine）：

原液浓度5 mg/mL，2~8℃避光保存原液，保质期约一年。

作用：秋水仙素可与微管蛋白二聚体结合，防止微管蛋白转换，破坏纺锤体，抑制有丝分裂，使染色体停滞在分裂中期，从而获得大量分裂相。

防护：秋水仙素有剧毒，但无挥发性，操作时做好个人防护，废液要倒入指定处，不可随意丢弃。

低渗液0.075 mol/L KCl：

配制：称取2.794 g KCl（AR），加蒸馏水至500 mL，充分溶解，常温保存。

作用：利用细胞膜的渗透作用，使细胞吸水膨胀，便于制片时细胞破裂，获得分散良好的染色体分裂相。

卡诺氏固定液（Carnoy固定液）：

配制：甲醇：冰乙酸=3：1，现用现配，长时间放置会产生酯化反应，生成乙酸甲酯，影响固定效果。

作用：能迅速穿透细胞，固定并维持染色体结构的完整性，增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。

防护：甲醇具有毒性，吸入过量或饮用会在肝内代谢，经醇脱氢酶作用氧化成甲醛，进而氧化成甲酸。冰醋酸无毒性，但有刺激性和腐蚀性。实验时需在通风橱中操作，并做好个人防护。

吉姆萨染液（姬姆萨染液、Giemsa染液）：

配制：3 mL Giemsa染色原液，1 mL丙酮与48.5 mL Gurr Buffer，现用现配。

注意：使用次数过多会减弱染色效果，建议控制在5次内。

0.25％胰酶溶液：

作用：Matsukuma用专门与蛋白质结合的荧光染料丹磺酰氯（dansyl-cl）染胰酶处理过的染色体，发现有明暗带纹，带型与G带一致。带区荧光强，非带区荧光暗，为此证明胰酶处理使非带区的蛋白质丢失，而带区蛋白仍保留。

操 作 流 程

染色体核型分析是以分裂中期染色体为研究对象，根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、随体的有无等特征，并借助显带技术对染色体进行分析、比较、排序和编号，根据染色体结构和数目的变异情况来进行诊断。核型分析可以为细胞遗传分类、物种间亲缘的关系以及染色体数目和结构变异的研究提供重要依据。

1. 秋水仙素处理：

a. 倒置显微镜下观察细胞状态，培养至细胞生长旺盛，汇合度约70-80%左右时收获。

b. 收细胞前2.5小时，向培养基内加入秋水仙素，使得终浓度为0.2 μg/mL。

c. 常规操作消化收集细胞至15mL带尖端的离心管内备用。

2. 低渗：

a. 在37度水浴箱中充分预热0.075mol/L KCL低渗液。

b. 常规操作离心细胞，去上清留下细胞沉淀，并加入8mL预热的低渗液，使用玻璃吸管吹打，充分混匀。

c. 加盖并置于37度水浴箱中，计时15 min。

d. 常规离心后，使用玻璃吸管移除上清，留下约0.5mL体积的残液，以免损失细胞。

3. 固定：

a. 轻轻刮动离心管底部，利用轻微震荡让膨胀的细胞沉淀重悬，可见悬液成为较为均匀的淡白状。

b. 预固定：沿着管壁滴加新鲜配制的固定液，边滴加边轻晃管身使其充分混匀，添加约1mL固定液，固定5min。

c. 常规转速离心10min，使用玻璃吸管弃去上清，留约0.5mL体积的残液。

d. 第一次固定：轻微震荡让底部细胞重悬，加入固定液5mL，使用玻璃吸管轻柔吹打数次即可。加盖避光，室温放置30min。

e. 常规转速离心10min，使用玻璃吸管弃去上清，留约0.5mL体积的残液。

f. 第二次固定：轻微的震荡让底部细胞重悬，加入固定液5ml，使用玻璃吸管轻柔吹打数次即可。加盖避光，室温放置30min。

g. 常规转速离心10min，使用玻璃吸管弃去上清，留约0.5mL体积的残液。

h. 轻微震荡让底部细胞重悬，形成细胞悬液。

4. 制片：

将玻片用酒精擦拭后晾干备用，使用时用镊子确定磨砂面为载玻片的正面。整个过程中，要避免手指接触以防在非磨砂区表面留下指印。

吸取少量（一般为100 μL）细胞悬液，悬空在30-40 cm高处将悬液逐步滴加到载玻片上，并尽量避开已滴加过的区域。

滴加完毕，立即在酒精灯的火焰下迅速过火固定几次，固定液挥发，玻片上会看到明显的细胞颗粒。标记样品相关内容并放置于玻片架晾干。

细胞密度以细胞不重叠，滴片后低倍镜下每视野100-200个细胞为宜。滴片后无需染色，可置于倒置相差显微镜下观察分裂相情况。

5. G显带染色：

a. 取2.5％胰酶溶液5mL，加入染色缸中，加入45mL生理盐水，用HCl或NaOH及酚红调节胰酶溶液成紫红色（pH6.8～7.2），置 37℃预温。

b. 玻片标本放入胰酶溶液中处理20～25 s，不断轻轻摇动玻片，使胰酶作用均匀。取出染色体玻片标本，置于37℃预温的生理盐水中涮洗片刻。立即放入37℃预温的Giemsa染液中，染色10min，用洗瓶（纯水）冲洗并用吹风机开启冷气流吹干。

备注：取3 mL Giemsa染色原液，1 mL丙酮与48.5 mL Gurr Buffer，配制Giemsa 染色应用液。

6. 分裂相拍照分析：

a. 低倍镜下找到分裂相，选分散良好、染色体轮廓清晰的单个细胞（分裂相）

选择标准：①分裂相需完整独立，染色体不过于松散，周围无其他距离很近的分裂相。②染色体形态适中，不过度短小或纤长，染色体彼此间无交联缠绕或者交联的染色体能明确的区分。③染色体G显带普遍较清晰，检测人员能够精确的判断染色体号别。

b. 将准备观察的目的物移至视野正中央，依次转换到高倍镜、油镜下观察。

c. 计数染色体个数，记录检测结果。

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