随着各型肝炎、肝硬化、肝癌等慢性肝病的发病率日益升高，体外培养的肝细胞也被广泛地用千肝病基础研究中。尽管细胞培养技术不断改进和成熟，国内外也先后建立了多株人肝癌细胞系，但体外分离和培养人正常肝细胞仍是非常有价值的研究材料。

一

材料与设备

1. 设备与器材   超净工作台、离心机、CO2 培养箱、－70℃ 冰箱、－20℃冰箱。

2. 无菌材料   大培养皿、青霉素小瓶、50ml 离心管、刻度吸管、弯头吸管、T25 培养瓶、手术剪、刀、镂、细胞筛（ 100 目）、消毒用乙醇棉球、流产胚胎、高糖DMEM 培养液、胎牛血清、青／链霉素、D-Hanks 溶液、0.25％胰蛋白酶/0.03%EDTA 消化液。

二

操作步骤

1. 消化法

（1）流产胚胎引出后， 于4℃ 保存，并尽快运输至实验室。

（2） 将胚胎置大培养皿中，用乙醇棉球将胚胎进行整体擦拭消毒。

（3）持手术镊、剪，从胚胎腹部切口，向下扩，取出肝脏，去除外膜后，用D-Hanks 溶液（ 含双倍双抗）洗涤3~5 次，至组织呈灰白色。

（4） 将组织剪碎至1mm3，移入青霉素小瓶，加少量D-Hanks 溶液混匀，用弯头吸管将剪碎的组织移至50ml 离心管中加D-Hanks 溶液清洗，然后以每分1000 转的速率离心6min。

（5）弃去上清液，加入15ml 的0.25% 胰蛋白酶／0.03%EDTA 消化液于室温下消化15min, 然后用吸管混匀，静置几秒钟，待组织块沉淀后弃去上清液。

（6）重新加入新鲜消化液15ml 消化10~15min, 混匀后将上清液（此时悬液中已含有消化下来的细胞）移入另一离心管，并用含20% 血清的DMEM 培养液终止消化，然后向原离心管中重新加入10~15ml 消化液消化，重复3~4 次。

（7） 将消化后收集的细胞悬液混合，过细胞筛。

（8） 筛后的细胞悬液移入离心管中，每分钟1000 转的速率离心6min , 弃去上清液， 用含20％胎牛血清的DMEM 培养液混匀，此时可在计数板计数，然后将细胞悬液按每瓶6~8ml（含细胞量1 x106个）移入T25 培养瓶中，于37℃ 、5%CO2培养箱中培养。次日，观察细胞贴壁情况 ， 弃去旧液，用D-Hanks 溶液洗后，换新鲜培养液于37℃  、5%CO2 培养箱中继续培养。

（9）原代培养的第三天，细胞长至80%~90% 汇合时，进行第一次传代。以后每3~ 4d 传代1次。按常规1: 3 传代方法进行操作。

2. 组织块贴壁法

（1） 流产胚胎引出后，于4℃ 保存并运输至实验室。

（2） 将胚胎置大培养皿中，用乙醇棉球将胚胎进行整体擦拭消毒。

（3） 持手术镊、剪，从胚胎腹部切口，取出肝脏，去除外膜后，用D-Hanks溶液（含双倍双抗）洗涤3 ~5 次，至组织呈灰白色。

（4）将组织剪碎至1mm3, 移入青霉素小瓶，然后吸入D-Hanks 溶液清洗2~

3 次。

（5） 将组织块移入T25 培养瓶，用弯头吸管将组织块轻轻剥离成单个，并均匀贴附在瓶壁，然后将贴附有组织块的培养瓶移入培养箱，翻转倒置4~6h, 至组织块贴牢。

（6） 加入6~8ml 含20％胎牛血清的DMEM 培养液，于37°C 、5%CO2 培养箱中培养。

（7） 3~7d 后于镜下观察，组织块周围会有细胞长出，细胞长多后就可看到“生长晕“。

（8） 原代培养过程中应保证每3d 换1 次培养液，细胞长至7~ 10d 时可进行第一次传代。以后每3~4d 传代1 次。按常规1 : 3 传代方法进行操作。

三

细胞鉴定

胚胎肝细胞可分泌甲胎蛋白(AFP)，培养上清液可检测到肝功能检测中的各种酶。

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