1、选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入等量完全培养基终止消化。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，5分钟)。

2、去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，加入10%的DMSO，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。

3、将上述细胞分装于冻存管中，将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。

4、先将冻存管置入置于4℃/30 min，再转入-20℃/2-h后，再放入-80℃冰箱冷冻过夜，次日保存到液氮罐中。

注：细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一支冻存管的细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。

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