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RIP实验步骤

添加时间:2022-11-07

RIP实验步骤

一、获取细胞裂解液

  • 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次

  • 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来,收集至eppendoff管

  • 1500rpm,4℃离心5min,弃上清,收集细胞

  • 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后于冰上静置5min

  • 每管分装200μl细胞裂解液,贮存于-80℃

二、制备磁珠-抗体

  • 重悬磁珠

  • 标记实验所需的eppendoff管

  • 吸取50μl 重悬后的磁珠悬液于每个eppendoff管

  • 每管加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡

  • 将eppendoff管置于磁力架上,去上清,重复一次

  • 用100μl的RIP Wash Buffer重悬磁珠

  • 室温孵育30min

  • 将eppendoff管置于磁力架上,弃上清

  • 加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后弃上清,重复一次

  • 加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后置于冰上

三、RNA结合蛋白免疫沉淀

  • 准备RIP Immunoprecipitation Buffer

  • 将前上步的eppendoff管放磁力架上,去上清,每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer

  • 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液,离心。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中,使得总体积为1ml

  • 4℃孵育3h至过夜

  • 短暂离心,将eppendoff管放在磁力架上,弃上清

  • 加入500μl RIP Wash Buffer,涡旋震荡后将eppendoff管放在磁力架上,弃上清,重复清洗6次

四、RNA纯化

  • 准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul

  • 用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物

  • 55℃孵育30min

  • 孵育完之后,将enpendoff管置于磁力架上,将上清液吸入一新的enpendoff管中

  • 于每管上清液中加入250μl RIP Wash Buffer

  • 于每管加入400μl苯酚:氯仿:异戊醇,涡旋震荡,室温下14,000rpm离心10min

  • 小心吸取350μl上层水相,吸入另一新的enpendoff管

  • 于每管加入400μl氯仿,涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min

  • 小心的吸取300μl上层水相,吸入另一新的enpendoff管

  • 每管加入50μl Salt SolutionⅠ,15μl Salt SolutionⅡ,5μl Precipitate Enhancer ,850μl 无水乙醇(无RNase),混合,-80℃保持1h至过夜

  • 14,000rpm,4℃离心30min,小心去上清

  • 用80%乙醇冲洗一次,14,000rpm,4℃离心15min,小心去上清,空气中晾干.

  • 10-20μl DEPC水溶解,-80℃保存。



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